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《化妝品衛生規范》(2007年版)金黃色葡萄球菌檢驗

發布時間:2014-10-24      瀏覽次數:9284    分享:

1  范圍 本規范規定了化妝品微生物學檢驗的基本要求。

本規范適用于化妝品樣品的采集、保存及供檢樣品制備。

2  儀器和設備

2.1 天平。

2.2 高壓滅菌器。

2.3 振蕩器。

2.4 三角瓶,250mL。

2.5 玻璃珠。

2.6 玻璃棒。

2.7 刻度吸管,1mL、10mL。

2.8 研缽或均質器。

2.9 恒溫水浴箱。

3  培養基和試劑

3.1 生理鹽水

成分:

氯化鈉       8.5g
蒸餾水加至1000mL

溶解后,分裝到加玻璃珠的三角瓶內,每瓶  90mL,103.43kPa(121℃  15  lb)20min

高壓滅菌。

3.2 SCDLP 液體培養基

成分:

酪蛋白胨 17g 
大豆蛋白胨 3g 
氯化鈉 5g 
磷酸氫二鉀 2.5g 
葡萄糖         2.5g 
卵磷脂 1g 
吐溫  80 7g 
蒸餾水 1000mL 

制法:先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后,再與其它成分混合,加熱溶解,調 pH

為 7.2~7.3 分裝,103.43kPa(121℃  15  lb)20min 高壓滅菌。注意振蕩,使沉淀于底層的 吐溫 80 充分混合,冷卻至 25℃左右使用。

注:如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨,也可用多胨代替。

3.3 滅菌液體石蠟。

3.4 滅菌吐溫 80。

3.5 7.5%的氯化鈉肉湯

成分:

蛋白胨 10g 
牛肉膏 3g 
氯化鈉 75g 
蒸餾水加至 1000mL 

制法:將上述成分加熱溶解,調 pH 為 7.4,分裝,103.43kPa(121℃  15  lb)15min 高 壓滅菌。

3.6 Baird Parker 平板

成分:

胰蛋白胨 10g 
牛肉膏 5g 
酵母浸膏 1g 
丙酮酸鈉 10g 
甘氨酸 12g 
氯化鋰(LiCl·6H2O) 5g 
瓊脂 20g 
蒸餾水 950mL 

pH7.0±0.2

增菌劑的配制:30%卵黃鹽水 50mL 與除菌過濾的 1%亞碲酸鉀溶液 10mL 混合,保存 于冰箱內。

制法:將各成分加到蒸餾水中,加熱煮沸完全溶解,冷至  25℃±1℃校正  pH。分裝每瓶 95mL,103.43kPa(121℃  15 lb)高壓滅菌 15min。臨用時加熱溶化瓊脂,每 95mL 加入 預熱至 50℃左右的卵黃亞碲酸鉀增菌劑 5mL,搖勻后傾注平板。培養基應是致密不透明的。 使用前在冰箱貯存不得超過 48h±2h。

3.7 血瓊脂培養基

成分:

營養瓊脂 100mL 
脫纖維羊血(或兔血) 10mL

制法:將營養瓊脂加熱融化,待冷至  50℃左右無菌操作加入脫纖維羊血,搖勻,制成 平板,置冰箱內備用。

3.8 甘露醇發酵培養基

成分:

蛋白胨 10g 
氯化鈉 5g 
甘露醇 10g 
牛肉膏 5g 
0.2%麝香草酚藍溶液 12mL 
蒸餾水 1000mL

制法:將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中,加熱溶解,調 pH7.4,加入甘露醇和 指示劑,混勻后分裝試管中,68.95kPa(115℃  10 lb)20min 滅菌備用。

3.9 兔(人)血漿制備

取 3.8%檸檬酸鈉溶液,103.43kPa(121℃  15  lb)30min 高壓滅菌,1 份加兔(人)全血 4 份,混勻靜置;2000rpm~3000rpm 離心 3min~5min。血球下沉,取上面血漿。

4  樣品的采集及注意事項

4.1 所采集的樣品,應具有代表性,一般視每批化妝品數量大小,隨機抽取相應數量的包裝單位。檢驗時,應分別從兩個包裝單位以上的樣品中共取 10g 或 10mL。包裝量小于 20g

的樣品,采樣量可適當增加樣品包裝數量。

4.2 供檢驗樣品,應嚴格保持原有的包裝狀態。容器不應有破裂,在檢驗前不得打開,防 止樣品被污染。

4.3 接到樣品后,應立即登記,編寫檢驗序號,并按檢驗要求盡快檢驗。如不能及時檢驗, 樣品應放在室溫陰涼干燥處,不要冷藏或冷凍。

4.4 若只有一個樣品而同時需做多種分析,如細菌、毒理、化學等,則宜先取出部分樣品 做細菌檢驗,再將剩余樣品做其它分析。

4.5 在檢驗過程中,從打開包裝到全部檢驗操作結束,均須防止微生物的再污染和擴散, 所用器皿及材料均應事先滅菌,全部操作應在無菌室內進行,或在相應條件下,按無菌操作 規定進行。

4.6 如檢出糞大腸菌群或其它致病菌,自報告發出之日起該菌種及被檢樣品應保存一個月。

5  供檢樣品的制備

5.1 液體樣品

5.1.1水溶性的液體樣品,可量取 10mL 加到 90mL 滅菌生理鹽水中,如樣品少于 10mL, 仍按 10 倍稀釋法進行。如為 5mL 則加到 45mL 滅菌生理鹽水,混勻后,制成 1:10 檢液。

5.1.2油性液體樣品,取樣品 10mL,先加 5mL 滅菌液體石蠟混勻,再加 10mL滅菌的吐

溫 80,在 40℃~44℃水浴中振蕩混合 10min,加入滅菌的生理鹽水 75mL(在 40℃~44℃ 水浴中預溫),在 40℃~44℃水浴中乳化,制成 1:10 的懸液。

5.2 膏、霜、乳劑半固體狀樣品

5.2.1親水性的樣品:稱取10g,加到裝有玻璃珠及 90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中,充分 振蕩混勻,靜置 15min。用其上清液作為 1:10 的檢液。

5.2.2疏水性樣品:稱取10g,放到滅菌的研缽中,加 10mL 滅菌液體石蠟,研磨成粘稠狀, 再加入 10mL 滅菌吐溫 80,研磨待溶解后,加 70mL 滅菌生理鹽水,在40℃~44℃水浴中 充分混合,制成 1:10 檢液。

5.3 固體樣品

稱取 10g,加到 90mL 滅菌生理鹽水中,充分振蕩混勻,使其分散混懸,靜置后,取上 清液作為 1:10 的檢液。

如有均質器,上述水溶性膏、霜、粉劑等,可稱  10g  樣品加入  90mL滅菌生理鹽水, 均質 1min~2min;疏水性膏、霜及眉筆、口紅等,稱 10g 樣品,加 10mL滅菌液體石蠟,

10mL 吐溫 80,70mL 滅菌生理鹽水,均質 3min~5min。

6  操作步驟

6.1 增菌:取 1:10 稀釋的樣品接種到 90mL SCDLP 液體培養基中,置36℃±1℃培養箱, 培養 24h±2h。

注:如無此培養基也可用 7.5%氯化鈉肉湯。

6.2    分離:自上述增菌培養液中,取 1~2  接種環,劃線接種在Baird Parker 氏培養基,如 無此培養基也可劃線接種到血瓊脂平板,置36℃±1℃培養 24h~48h。在血瓊脂平板上菌落 呈金黃色,大而突起,圓形,不透明,表面光滑,周圍有溶血圈。在 Baird Parker 氏培養基 上為圓形,光滑,凸起,濕潤,直徑為  2mm~3mm,顏色呈灰色到黑色,邊緣為淡色,周 圍為一混濁帶,在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到 非脂肪溶解的類似菌落,但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上,置  36℃±1℃培養 24h±2h。

6.3 染色鏡檢:挑取分純菌落,涂片,進行革蘭氏染色,鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏 陽性菌,排列成葡萄狀,無芽胞,無夾膜,致病性葡萄球菌,菌體較小,直徑約為 0.5?m~1?m。

6.4 甘露醇發酵試驗:取上述分純菌落接種到甘露醇發酵培養基中,在培養基液面上加入2mm~3mm的滅菌液體石蠟,置36℃±1℃培養 24h±2h,金黃色葡萄球菌應能發酵甘露醇 產酸。

5.5 血漿凝固酶試驗:吸取 1:4 新鮮血漿 0.5mL,放入滅菌小試管中,加入待檢菌 24h±2h 肉湯培養物 0.5mL。混勻,放36℃±1℃恒溫箱或恒溫水浴中,每半小時觀察一次,6h 之內 如呈現凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養物及肉湯培養基各0.5mL,分別加入滅菌 1:4 血漿 0.5mL,混勻,作為對照。

6  檢驗結果報告 凡在上述選擇平板上有可疑菌落生長,經染色鏡檢,證明為革蘭氏陽性葡萄球菌,并能

發酵甘露醇產酸,血漿凝固酶試驗陽性者,可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。

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圖1:《化妝品衛生規范》(2007年版)金黃色葡萄球菌檢驗流程圖

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